GV3101（pSoup-19） Electroporation-Competent Cell   根癌(電擊)感受態(tài)細(xì)胞

基因型：

C58 (rifR) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR)Nopaline(pSoup-p19-tetR)

簡(jiǎn)要說(shuō)明：

P19蛋白來(lái)源于番茄叢矮病毒，可抑制宿主對(duì)外源基因的RNA沉默效應(yīng)，提高異源基因轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)異源蛋白的表達(dá)，廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物及煙草葉片，擬南芥葉片，番茄葉片或原生質(zhì)體的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中。GV3101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——li福平抗性基因rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一無(wú)自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是TDNA插入植物基因組必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。

pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：gent，賦予GV3101菌株qing大霉素抗性；在GV3101菌株中轉(zhuǎn)入help質(zhì)粒：pSoup-p19即為GV3101(pSoup-p19)菌株，可幫助pGreen，62SK，pGs2等質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中復(fù)制，同時(shí)賦予該菌株四環(huán)素（tet）抗性。適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作。AngYuBio GV3101 (pSoup-p19)電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：經(jīng)pGs2(ka那霉素抗性)質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>105 cfu/ μgDNA。

操作說(shuō)明：

1.0.2cm電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2.取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入1-5ug質(zhì)粒DNA（質(zhì)粒體積不大于6ul，最好用試劑盒抽提，雙蒸水溶解），用手bo打管底混勻，立即插入冰中，用200ul槍頭將感受態(tài)-質(zhì)?；旌衔锟焖僖频诫姄舯?，蓋上杯蓋，空管保留待用。

3.啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25uF，PC=200ohm，V=2400V（此參數(shù)為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中，加入700ul 無(wú)抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中，28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。

4.6000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天（當(dāng)平板只含有50ug/ml kan 時(shí)，28℃培養(yǎng)48h即可；平板中同時(shí)加入50ug/ml kan，20ug/ml rif 時(shí)，需28℃培養(yǎng)60h；如果使用的平板含有50ug/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90h）。

注意事項(xiàng)：

1.加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10 ；質(zhì)粒不純或存在鹽，乙醇等污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；若轉(zhuǎn)化大質(zhì)?；蛳氆@得較高轉(zhuǎn)化效率，推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

2.混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。

3.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

4.li福平濃度不應(yīng)高于25ug/ul，過(guò)高的li福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，會(huì)降低其生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司感受態(tài)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率時(shí)所用平板只含有50ug/ml kan，若所用平板含有20ug/ml rif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。

5.培養(yǎng)基中加入li福平的目的是防止雜菌生長(zhǎng)、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入lian霉素或qing大霉素可防止Ti質(zhì)粒丟失，但lian霉素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮lian霉素或請(qǐng)大霉素，Ti質(zhì)粒丟失的概率極低（可以忽略）。